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ⓘ Ingegneria tissutale




Ingegneria tissutale
                                     

ⓘ Ingegneria tissutale

L ’ingegneria tissutale è il settore terapeutico interdisciplinare che si pone lobiettivo di soddisfare le esigenze mediche legate a tessuti e organi ricreandoli, ingegnerizzandoli o favorendone la riparazione ; ristabilendo, ricreando o migliorando, quindi, le loro originarie funzioni biologiche.

Essa rappresenta anche uno degli strumenti utilizzati dalla medicina rigenerativa.

Lingegneria tissutale, inoltre, studia la progettazione e la realizzazione di bioreattori dove vengono prodotti organi e tessuti, partendo dallinseminazione di cellule in opportuni scaffold; ovvero delle impalcature tridimensionali, di varia natura, che sostengono larchitettura cellulare.

Gli scaffold, che in genere sono in materiale nanocomposito polimerico biocompatibile, sono ingegnerizzati al fine di permettere una miglior adesione, crescita, differenziazione e diffusione cellulare; definendo la forma finale dellorgano o tessuto da rigenerare.

Nellultimo decennio si è posta particolare attenzione allo sviluppo di scaffold tridimensionali, bioreattori e dispositivi organ-on-chip.

                                     

1. Storia

Il termine ingegneria tissutale compare attorno agli anni settanta del secolo scorso inteso unicamente come manipolazione di tessuti e organi; in seguito il termine assume la moderna accezione, ovvero viene definito come quel campo interdisciplinare che applica i principi e i metodi dellingegneria e delle scienze della vita al fine di sviluppare dei sostituti biologici per il mantenimento, la riparazione, la sostituzione o il potenziamento funzionale di tessuti biologici o interi organi.

Nel 1994 venne costituita a Boston la società di ingegneria tissutale il cui acronimo era TES Tissue Engineering Society, inoltre venne fondata la rivista specialistica" Tissue engineering” i.e. ingegneria tissutale.

La TES si trasformò in seguito in TESI Tissue Engineering Society International ed infine, un decennio dopo 2005 dallunione di questultima con altre società di ingegneria tissutale, quali quella europea ETES: European Tissue Engineering Society e varie omologhe asiatiche, nacque la società TERMIS Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society, comprendendo oltre allingegneria tissutale anche il settore della medicina rigenerativa.

Lingegneria tissutale ottenne una grande popolarità grazie al servizio televisivo della BBC, nel quale si dimostrava la possibilità di ingegnerizzare il tessuto cartilagineo mostrando ai telespettatori un topo con un orecchio umano innestato sulla sua schiena.

Il futuro di questo settore dellingegneria e della medicina è quello, tramite lutilizzo di nuove tecnologie e materiali, di rigenerare o sostituire tessuti e organi danneggiati o compromessi da patologie, malattie o traumi.

                                     

2. Nanomateriali nellingegneria tissutale

Nei tessuti naturali le cellule sono immerse in una matrice extracellulare ECM: extracellular matrix caratterizzata da una struttura di nanofibre naturali organizzate gerarchicamente a formare un network polimerico che, tramite le interazioni che si generano tra le nanofibre le cellule, permette:

  • il sostegno dellintera architettura cellulare determinando, quindi, la morfologia del tessuto;
  • influire sul comportamento delle cellule proliferazione, differenziazione e migrazione grazie e stimoli ed interazioni biomeccaniche legandosi ai fattori di crescita ed interagendo con i recettori superficiali delle cellule;
  • influire sulle proprietà biochimiche e biomeccaniche resistenza a compressione e a trazione, elasticità… dei diversi tessuti e organi.

La matrice extracellulare naturale è principalmente costituita da tre classi di biomolecole:

  • proteine fibrose strutturali come collagene fibrillare in particolare del tipo I, II e III ed elastina: il collagene impartisce integrità strutturale e resistenza ai tessuti, mentre lelastina ne aumenta le proprietà elastiche;
  • proteoglicani molecole proteiche che si formano dallunione di glicosamminoglicani GAGs: polisaccaridi a catena non ramificata con proteine dellECM): permettono di legare e immagazzinare i fattori di crescita allinterno dellECM;
  • polisaccaridi non-proteoglicani: un esempio è lacido ialuronico che impartisce resistenza a compressione ai tessuti grazie alla sua capacità di rigonfiarsi in presenza di acqua.

A causa della dimensione nanoscopica dei costituenti della matrice extracellulare il diametro delle proteine strutturali si pone tra i 50 e i 500 nm, è sorto un naturale interesse nellimpiego di nanomateriali e nanotecnologie nellingegneria tissutale.

Attualmente, infatti, in questo ambito applicativo vengono impiegati biomateriali e nanocompositi polimerici nella sintesi di scaffold che imitano la matrice extracellulare in quanto possiedono un alto grado di affinità con i costituenti del microambiente cellulare, ovvero sono capaci di imitare la composizione, la topografia e larchitettura dei tessuti umani.

Dal momento che ogni tipologia di tessuto è caratterizzata da una ECM avente una composizione e struttura che ne impartisce proprietà biochimiche e biomeccaniche specifiche, le matrici extracellulari sintetiche dovranno essere specificamente prodotte per quel particolare tessuto che si vuole ricreare o riparare; ottenendo una corretta interconnettività e porosità che faciliti la crescita e la migrazione cellulare allinterno della struttura porosa dello scaffold, al fine di evitare un sovrappopolamento che ostacola la crescita cellulare e favorire lapporto delle sostanze nutritive i.e. vascolarizzazione.

Inoltre, gli scaffold dovranno essere costituiti da materiali biocompatibili che, una volta innestati in vitro o in vivo, possano essere rimossi dallorganismo tramite degradazione o riassorbimento lasciando solamente tessuto biologico.

Il successo nella rigenerazione di tessuti dipende, dunque, grandemente dalla capacità, tramite limpiego di nanotecnologie, di produrre e ingegnerizzare materiali biomimetici che simulino alla nanoscala la complessità le funzionalità del microambiente cellulare; ricreando un ambiente che supporti e regoli le funzioni cellulari necessarie alla sintesi dei diversi tessuti.

                                     

2.1. Nanomateriali nellingegneria tissutale Nanomateriali e materiali nanocompositi polimerici

I materiali nanocompositi sono sistemi bifasici o multifasici, costituiti da due o più componenti ciascuno dei quali corrisponde a una fase differente; con almeno uno di essi nanofiller caratterizzato da almeno una dimensione nanometrica.

Solitamente un componente costituisce la matrice omogenea nella quale sono ospitate una o più fasi disperse che ne costituiscono il rinforzo o carica nanofiller.

A differenza dei materiali compositi, laggiunta di nanofiller permette di rafforzare la matrice polimerica utilizzandone una quantità considerevolmente minore 1-5 wt% rispetto a 10-70 wt% dei compositi tradizionali.

Questo avviene perché i vari componenti sono associati tra loro a livello micro-nanoscopico in modo tale da combinare opportunamente le loro proprietà, coniugandole in un unico materiale riducendone drasticamente la massa; permettendo, quindi, un incremento delle proprietà meccaniche, chimiche, fisiche, termiche e di barriera, oltre che una maggiore resistenza a fatica e usura della matrice associata.

Ciò spiega perché i materiali nanocompositi polimerici trovano un naturale impiego non solo nellingegneria tissutale, ma più in generale in ambito biomedicale dove permettono un miglioramento delle tecniche diagnostiche e terapeutiche nanocompositi polimerici, nanoparticelle internamente strutturate….



                                     

2.2. Nanomateriali nellingegneria tissutale Biocompatibilità e tossicità dei nanomateriali nellingegneria tissutale

A causa del potenziale impiego di una vasta classe di nanomateriali e nanocompositi in particolare quelli avente una matrice polimerica in ambito biomedico, sorge il problema di valutare la biocompatibiltà e leventuale tossicità di tali possibili candidati nei confronti dei sistemi biologici viventi con cui entreranno in contatto.

La biocompatibilità è definita come labilità di un materiale ad operare in una specifica situazione con lappropriata reazione dellambiente ospitante; questo significa che il materiale promuove ladeguata risposta del corpo e che contemporaneamente questo non sviluppa una reazione avversa al materiale stesso.

Per tossicità si intende, invece, la capacità di una sostanza, a determinate dosi o concentrazioni, di provocare danni e rischi anche gravi, acuti o cronici a carico degli organismi viventi ai quali sia stata somministrata o che siano venuti in contatto con essa.

Risulta, quindi, estremamente importante valutare la risposta specifica di cellule e tessuti sotto condizione di esposizione acuta o cronica e a dosi farmacologiche o tossicologiche ad ogni nanocomposito candidato tramite test:

  • in vivo utilizzando modelli animali;
  • in vitro tramite test di
  • emocompatibilità: permette di stabilire il grado di coagulazione del sangue sui biomateriali o sui dispositivi che entrano in contatto con il sangue.
  • citocompatibilità: permette di stabilire la citotossicità di un materiale, valutando se linterazione con il biomateriale provoca la morte o alterazioni negative delle cellule;

Tali analisi dovrebbero essere un passaggio preliminare per lo sviluppo di qualsiasi materiale avente impiego biomedico.

Le diverse proprietà e reattività dei nanomateriali, rispetto ai materiali aventi dimensioni macroscopiche, sono dovute ad un aumento della superficie specifica che provoca un aumento della reattività, uneventuale carica superficiale maggiore ed una maggiore tendenza ad agglomerarsi formando dei clusters.

La biocompatibilità ed eventuale tossicità dei nanomateriali dipende da vari fattori: composizione delle particelle, dimensione, concentrazione, forma, stato di aggregazione, reattività e carica superficiale, potenziali di attrazione elettrostatica, metodi di sintesi e modificazione.

Per poter stabilire la quantità di nanomateriale che un organismo può assumere, bisogna tener conto di fattori quali la potenziale tossicità, il metabolismo, la stabilità, i meccanismi di smaltimento e laccumulo in vivo.

Diversi sono pure i modi e i tempi con i quali un organismo può venire a contatto con le nanoparticelle, parametri importanti per stabilire la loro tossicità.

Le nanoparticelle possono penetrare allinterno di un organismo vivente tramite:

  • inalazione ;
  • ingestione fattori determinanti: dimensione, forma e composizione;
  • attraverso lepidermide fattori determinanti: dimensione.

La risposta delle cellule allesposizione di nanoparticelle è molto varia e dipende dalla natura delle nanoparticelle, dalla tipologia delle cellule interessate e dalle condizioni di esposizione.

Gli effetti citotossici e biologici dati da un accumulo di nanoparticelle nel tempo, a seguito di una somministrazione, sono di difficile valutazione; infatti le tecniche utilizzate in vitro sono poco efficacemente replicabili in vivo microscopia elettronica o a forza atomica e questo vale anche per le tecniche di marcatura radioattiva, fluorescente o chimica se le particelle penetrate non sono superficialmente modificate.

                                     

2.3. Nanomateriali nellingegneria tissutale Biomateriali

Tra i biomateriali utilizzati nellingegneria tissutale come componenti della matrice extracellulare, ovvero di quellimpalcatura tridimensionale i.e. scaffold che sostiene lintera architettura cellulare, spiccano i cosiddetti nanobiomateriali, ovvero quei materiali avente almeno una dimensione nanometrica che si interfacciano con lambiente biologico.

Grazie alla struttura reticolare che vanno a formare, la presenza temporanea dei nanobiomateriali permette delle interazioni meccaniche dirette con le cellule in particolare con i recettori superficiali, fungendo da mezzo per fornire segnali adatti a manipolare larchitettura cellulare.

Lutilizzo ottimale di questi biomateriali potrebbe, almeno potenzialmente, permetterci di comprendere il linguaggio cellulare per" istruire” ed alterare il comportamento delle cellule nella riparazione di tessuti e nella ricostruzione di organi.

Unampia classe di biomateriali viene impiegata nellingegneria tissutale grazie alla loro biocompatibilità, biodegradabilità i.e. non rendono necessarie successive operazioni atte alla loro rimozione, in quanto le parti degradate non sono tossiche per lorganismo e vengono espulse tramite le naturali vie di smaltimento ed un costo relativamente basso; inoltre, la loro struttura favorisce ladesione, la crescita, la proliferazione e la differenziazione delle cellule, impartendo le desiderate proprietà meccaniche, chimiche e biologiche al tessuto.

I principali biomateriali naturali utilizzati nellambito dellingegneria tissutale sono: fibronectina, collagene, polipeptidi, glicosaminoglicani, idrossiapatite e alginato.

Per quanto riguarda i biomateriali sintetici, sono fortemente impiegati i nanocompositi polimero-silicato grazie alla loro biocompatibilità e allincremento delle proprietà meccaniche ottenibili con laggiunta di nanoparticelle silicatiche.

I nanofiller più comunemente utilizzati sono silice, Montmorillonite naturale o modificata Cloisite, Bentonite, Wollastonite, Laponite unargilla sintetica del tipo Hectorite e vetri bioattivi sintetici.

Come esempi di sistemi polimero-silicato si citano:

  • Acido polilattico-co-glicolico PLG – Montmorillonite MMT: laggiunta di piccole quantità di MMT aumenta la tenacità e lelongazione del PLG dal 7% al 210% in test di trazione, a causa di un cross-linking fisico che si realizza tra polimero e nanoparticelle → impiegati in suture.
  • Acido poli-L-lattico PLLA – Montmorillonite MMT: laggiunta di MMT provoca un aumento del 40% del modulo elastico dellimpalcatura scaffold in PLLA, un decremento della cristallinità del polimero causa le interazioni di superficie e quindi un aumento della sua degradazione; inoltre, favorisce una maggiore integrità strutturale durante la biodegradazione del polimero, un aumento della rigidità e della trasparenza a concentrazioni e con un grado di esfoliazione di MMT maggiori → impiegati nelle impalcature degradabili per lingegneria tissutale.

A seconda del tessuto da ingegnerizzare si utilizzano materiali diversi in modo tale da ottenere proprietà che si più avvicinano al corrispettivo naturale; di seguito verranno descritte le proprietà di diversi tessuti umani ingegnerizzabili e i materiali impiegati per la loro rigenerazione.

                                     

2.4. Nanomateriali nellingegneria tissutale Tessuto osseo

Il tessuto osseo è un tessuto connettivo mineralizzato il cui scopo principale è il supporto strutturale del corpo, nonché permettere il movimento dello stesso e la protezione degli organi vitali; la sua matrice è un materiale nanocomposito costituito da una fase organica costituita da proteine fibrose strutturali, principalmente collagene fibrillare del tipo I e una fase inorganica cristalli di idrossiapatite HA o HAP: è la forma minerale idrossilata dellapatite, minerale costituito da ioni calcio e ioni fosfato) che impartisce al tessuto notevole resistenza meccanica e durezza.

Nella progettazione di dispositivi protesici risulta importante lintegrazione tra il materiale sintetico e il tessuto osseo circostante; per tale motivo, nello sviluppo di biomateriali per la rigenerazione osseo-tissutale, vengono impiegati materiali nanostrutturati in quanto sono in grado di imitare sia la struttura che la composizione dellosso naturale, favorendo ladesione, la crescita e la proliferazione degli osteoblasti ed impartendo adeguate proprietà al tessuto.

Nella fattispecie gli scaffold utilizzati devono possedere le seguenti caratteristiche: elevata resistenza meccanica, porosità e durezza, oltre ad unappropriata architettura tridimensionale.

Materiali largamente usati nella produzione dello scaffold sono:

  • pur non essendo biodegradabili il che limita il loro impiego in questo settore biomedico, i nanotubi in carbonio possono essere rapidamente rimossi dal corpo tramite le naturali vie di smaltimento dellorganismo; inoltre la loro citotossità può essere ridotta tramite una funzionalizzazione chimica superficiale;
  • polimeri sintetici e naturali e.g. acido poliglicolico PGA, acido polilattico-co-glicolico PLGA, acido poli-L-lattico PLLA, acido polilattico PLA, policaprolattone PCL, collagene…): grazie alla loro biodegradabilità e facilità di fabbricazione vengono impiegati come fase organica nella sintesi di uno scaffold con struttura tridimensionale continua avente unalta area superficiale e porosità;
  • lelevato rapporto daspetto permetterebbe di ottenere uno scaffold con un maggior grado di allineamento delle fibre per imitare più efficacemente il tessuto osseo in vivo ;
  • nanoceramici e.g. nanocristalli di idrossiapatite, allumina e ossido di zinco: aumentano le proprietà meccaniche e osteo-conduttive, inoltre permettono di cementare tra loro le varie parti ossee;
  • nanotubi in carbonio funzionalizzati con fosfati sostituiscono il ruolo del collagene fibrillare del tipo I come sito di nucleazione per la deposizione e cristallizzazione dellidrossiapatite HAP durante le prime fasi di formazione del tessuto osseo dopo 14 giorni di mineralizzazione lo strato di HAP raggiunge uno spessore di 3 mm;
  • nanotubi in carbonio → la loro conduttività elettrica può essere sfruttata in substrati per dirigere e aumentare la crescita cellulare e stimolare la formazione ossea
  • applicando una corrente alternata al substrato, nanocompositi a base di acido polilattico PLA e nanotubi in carbonio a singola parete hanno dimostrato un incremento della proliferazione osteoblastica del 46% e della produzione di calcio superiore al 300%;
  • nanoparticelle metalliche.

Nel corpo umano la presenza in vivo di silicio permette la formazione di cartilagini e di ossa, grazie alla sua partecipazione al metabolismo cellulare; inoltre, nei tessuti connettivi può agire come agente di cross-linking.

Partendo da questo suo ruolo importante, si è cercato di ingegnerizzare substrati in polimeri biodegradabili in associazione a materiali nanostrutturati contenenti ossidi di silicio.

Come esempio si citano:

  • Silice – chitosano: le nanostrutture in silice aumentano le proprietà meccaniche e biologiche del materiale, favorendo ladesione e la proliferazione cellulare; inoltre, quando immerso in un fluido corporeo, il nanocomposito induce la deposizione di minerali di calcio e fosforo, indice di una bioattività in vitro → vengono utilizzati come membrane nella rigenerazione ossea.
  • Biovetro – poli3-idrossibutirrato P3HB: la presenza di biovetro determina un aumento delle proprietà meccaniche del polimero e della sua bioattività grazie alla formazione di uno strato superficiale di idrossiapatite quando il sistema è immerso in un fluido corporeo; inoltre, allaumentare della sua concentrazione aumenta la perdita di peso e lassorbimento di acqua da parte del sistema; il nanocomposito permette ladesione, la proliferazione e la differenziazione di osteoblasti sulla sua superficie.


                                     

2.5. Nanomateriali nellingegneria tissutale Tessuto vescicale

Il tessuto della vescica, insieme a quello della pelle, è stato uno dei primi tessuti a venire ingegnerizzato in quanto strutturalmente sottile e relativamente semplice.

Analogamente ai tessuti ossei e cartilaginei, anche per i tessuti molli come quello della vescica, i nanomateriali sembrano essere la migliore soluzione ingegneristica grazie alle loro proprietà che permettono un aumento della velocità di rigenerazione del tessuto.

I materiali principalmente utilizzati sono nanofibre polimeriche elettrofilate che sono in grado di imitare le nanostrutture orientate che compongono il tessuto muscolare della vescica.

Gli studi attuali sono rivolti sulla ricerca di nanofibre polimeriche il più possibile biocompatibili, come ad esempio nanostrutture in acido polilattico-co-glicolico PLGA assieme a film di poliuretano PU le quali sembrano accrescere le funzioni cellulari del tessuto vescicale.

                                     

2.6. Nanomateriali nellingegneria tissutale Tessuto epiteliale

La rigenerazione della pelle, nel caso di suturazioni di ferite o ampie zone di epidermide da sostituire come nei casi di ustione, ha compiuto un notevole progresso grazie allingegneria tissutale, dove si cerca di riprodurre un tessuto con proprietà il più simile possibile allepidermide in modo da non provocare cicatrici che limitano i movimenti, causano dolore e sono esteticamente indesiderate.

Numerosi materiali naturali come il collagene, il chitosano e la laminina vengono utilizzati come scaffold nellingegnerizzazione della pelle in quanto possiedono caratteristiche simili a quelle dei componenti della pelle naturale.

Sono stati studiati, inoltre, polimeri naturali e sintetici quali nanofibre di fibroina della seta, una proteina fibrosa prodotta da ragni e alcuni insetti; lo scaffold prodotto con tale materiale presenta unelevata porosità e area specifica che sembra promuovere ladesione e la propagazione dei cheratinociti i.e. il tipo di cellule più abbondante nellepidermide.

Per quanto riguarda, invece, la medicazione di ferite, tra i materiali che suscitano maggior interesse sono le membrane di nanofibre in poliuretano PU, le quali sembrano garantire unottima permeabilità allossigeno e un controllo sullevaporazione dellacqua, impedendo lingresso nellorganismo, tramite la ferita, di microorganismi che potrebbero produrre infezioni.

                                     

2.7. Nanomateriali nellingegneria tissutale Tessuto nervoso

Il tessuto nervoso è il componente principale delle due parti che costituiscono il sistema nervoso negli esseri viventi più evoluti: quello centrale e quello periferico formato dai gangli nervosi e dai nervi che si irradiano dal sistema nervoso centrale verso le estremità del corpo, il cui scopo è quello di ricevere e trasmettere gli stimoli sensoriali e motori interni ed esterni.

Risulta composto da due tipologie di cellule: i neuroni che ricevono e trasmettono gli impulsi le cellule gliali o neurogliali, che assistono la propagazione dellimpulso nervoso e forniscono i nutrienti ai neuroni.

Rispetto ad altri tessuti umani, quello nervoso risulta essere molto delicato e può essere danneggiato da diverse condizioni patologiche; inoltre è molto più complicato da riprodurre.

Condizione necessaria per una sua efficace riproduzione, è limpiego di un materiale avente citocompatibilità e proprietà meccaniche per il sostegno del tessuto ed elettriche per la trasmissione degli stimoli eccellenti, in modo tale da ottenere la corretta crescita dei neuroni ed evitare linsorgenza di infiammazioni o infezioni.

Attualmente, per la sintesi dello scaffold su cui far crescere e differenziare le cellule staminali, si utilizzano matrici polimeriche o gel polimerici biocompatibili caricate con film di nanotubi o nanofibre per cercare di riprodurre le proprietà del tessuto nervoso naturale ovvero trasmettere segnali elettrochimici creare nuove sinapsi.

Ottimi risultati sono stati ottenuti sfruttando le proprietà elettriche di nanotubi in carbonio e film di grafene come substrati per la crescita dei neuroni.

                                     

2.8. Nanomateriali nellingegneria tissutale Tessuto cardiaco

Il tessuto cardiaco se subisce delle lesioni causa, ad esempio, un infarto al miocardio o unischemia, non riesce ad auto-ripararsi, per cui i danni subiti risultano irreversibili; le uniche cure ad oggi sono il trapianto di cuore.

La ricerca nellingegneria tissutale ha permesso di riprodurre il tessuto cardiaco tramite limpiego di cellule staminali, fattori di crescita e biomateriali; diverse, però, sono le difficoltà incontrate a causa delle peculiari caratteristiche delle cellule cardiache.

Il tessuto cardiaco, infatti, possiede proprietà elettriche e di contrazione, oltre ad essere anisotropo; le proprietà elettriche, in particolare, sono state riprodotte da nanostrutture a base di carbonio e.g. monostrati di grafene oppure di grafene ossidato e nanoparticelle in oro.

                                     

3. Tessuti artificiali e naturali

I tessuti artificiali ricreati o riparati risultano avere proprietà meccaniche e strutturali inferiori rispetto a quelle dei tessuti naturali; questo, assieme ad una bassa velocità di vascolarizzazione i.e. velocità del processo di formazione di nuovi vasi sanguigni, risulta essere uno degli ostacoli più grandi riguardante la produzione di tessuti artificiali; attualmente si è in grado di ricreare in vitro o in vivo solamente tessuti strutturalmente sottili e relativamente semplici come la pelle, le cartilagini e la vescica.

Queste differenze tra tessuti artificiali e naturali possono essere imputabili ai nanomateriali e nanocompositi polimerici impiegati e alla struttura interna del tessuto artificiale; un progresso in tale settore può essere raggiunto ingegnerizzando le matrici extracellulari e promuovendo una rapida formazione dellambiente cellulare.

La maggiore sfida in questo campo risulta essere, infatti, la creazione di tessuti tridimensionali la cui condizione necessaria per la durabilità è un elevato ordine interno a livello nano e micrometrico avente funzionalità sempre più complesse, con una maggiore stabilità funzionale e biomeccanica.

La vascolarizzazione o angiogenesi è fattore fondamentale nella progettazione di tessuti artificiali; infatti la crescita di nuovi vasi sanguigni risulta essenziale per il rifornimento di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule del tessuto in formazione, favorendone la crescita e la rigenerazione.

Una bassa vascolarizzazione dei tessuti artificiali può comportare, inoltre, un accumulo di prodotti di scarto che possono provocare disturbi locali temporanei.

Un aumento della vascolarizzazione può essere ottenuto grazie ad un rilascio controllato e localizzato dei fattori angiogenetici e.g. fattori di crescita vascolare endoteliari, fattori di crescita fibroblastica… dagli scaffold, sfruttando varie nanotecnologie:

  • nanoparticelle target opportunamente modificate con specifici ligandi cellulari o molecole di segnalazione: signaling molecules fatte aderire sulla superficie dello scaffold;
  • nanotubi in carbonio funzionalizzati che permettono un controllo della produzione e del trasporto dei vari fattori di crescita alle cellule.

I recenti sviluppi e progressi nellambito dei biomateriali, delle cellule staminali, dei fattori di crescita e differenziazione e della biomimetica hanno permesso il successo dellingegneria tissutale nello sviluppo di tessuti che combinano matrici extracellulari ingegnerizzate i.e. scaffolds, cellule e molecole biologicamente attive; ponendo le basi per un effettivo" rimpiazzo” di parti umane.



                                     

3.1. Tessuti artificiali e naturali Proprietà dello scaffold e influenza dei nanomateriali sulle proprietà finali

Un fattore determinante per il successo dellingegneria tissutale nella riparazione e sintesi di tessuti e organi risulta essere la corretta progettazione dello scaffold; dal momento che deve rimpiazzare la matrice extracellulare naturale, lo scaffold dovrà influire correttamente sulle proprietà biomeccaniche, biochimiche e biologiche del tessuto e delle cellule.

In particolare dovrà soddisfare i seguenti requisiti:

  • possedere un grado di porosità tale che gli interstizi o pori abbiano unadeguata dimensione e costituiscano un reticolo percolativo che favorisca la crescita e disposizione cellulare, lapporto di sostanze nutritive e lo smaltimento dei prodotti metabolici;
  • le fibre che costituiscono lo scaffold siano biocompatibili, non tossiche e bioriassorbibili, con una velocità di riassorbimento e degradazione compatibile con quella di formazione del nuovo tessuto, in modo tale che al termine del processo di sintesi il tessuto sia costituito unicamente da materiale biologico;
  • avere unalta area superficiale e adeguate proprietà fisico-chimiche superficiali tali da favorire ladesione, la crescita, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare grazie a corrette interazioni cellula – scaffold;
  • imprimere al tessuto sintetico proprietà meccaniche simili al tessuto naturale che si vuole rimpiazzare, in modo tale da favorire un suo corretto funzionamento con i tessuti circostanti una volta innestato in vivo ; sopportando, perciò, i carichi e stress fisiologici cui sarà soggetto ed evitando linsorgere di zone di accumulo di stress residuo allinterfaccia tra il tessuto sintetico e lambiente circostante che possono portare ad un degrado o rottura accelerata del tessuto artificiale o di quelli circostanti ;
  • mantenere adeguate proprietà meccaniche per assicurare lintegrità strutturale del tessuto e larchitettura cellulare, soprattutto durante la sua fase di degradazione.

Nei tessuti naturali larchitettura cellulare i.e. lorientazione tridimensionale delle cellule che definisce la forma del tessuto, e di conseguenza le proprietà biomeccaniche, è garantita dalle dimensioni nanometriche delle proteine strutturali dellECM avente un diametro di 50-500 nm, le quali sono 1 o 2 ordini di grandezza inferiori alle dimensioni cellulari; ciò permette alle cellule un contatto diretto con il maggior numero di fibre possibili.

Dal momento che uno dei fattori determinanti per il successo dello scaffold nella sintesi di tessuti artificiali è quella di ottenere proprietà analoghe a quelle del tessuto naturale che si vuole sostituire, risulta fondamentale riuscire a produrre fibre sintetiche avente diametri nanometrici.

Purtroppo le tecniche convenzionali di processing i.e. lavorazione dei polimeri non sono in grado di ottenere filati avente diametri inferiori a 10 µm; perciò sono state sviluppate tecniche innovative campo di ricerca tuttora in forte sviluppo per ottenere fibre nanometriche che permettano di simulare efficacemente la geometria dellECM.

Le proprietà biomeccaniche del tessuto, oltre a dipendere dalle dimensioni nanometriche delle fibre dello scaffold, dipendono da una disposizione tridimensionale ordinata ed organizzata delle cellule, che può essere raggiunta grazie allimpiego di nanograte che fungono da substrato per la coltura cellulare o di scaffold con un forte grado di allineamento delle nanofibre.

È stato dimostrato che lallineamento delle nanofibre influenza lallineamento e lelongazione delle cellule, guidando una crescita cellulare avente la desiderata anisotropia; inoltre, permette uninfiltrazione cellulare più efficiente in quanto i pori, avente una maggiore dimensione, vanno a formare un reticolo percolativo più ordinato ad organizzato.

Il controllo della dimensione dei pori e della porosità dello scaffold permette, oltre ad un miglioramento della proliferazione cellulare e della vascolarizzazione, un controllo sulle proprietà meccaniche dello scaffold e quindi del tessuto finale.

Risulta, perciò, fondamentale ottenere valori ottimali di porosità e dimensione dei pori; infatti, se unalta porosità e dimensione dei pori aumenta la vascolarizzazione e facilita ladesione e la crescita cellulare, per contro le proprietà meccaniche dello scaffold risultano essere insufficienti causa un valore eccessivo di vuoto interno.

Un scaffold, invece, con una porosità troppo bassa comporterebbe delle proprietà meccaniche elevate a scapito di uninsufficiente vascolarizzazione, crescita e migrazione cellulare con una conseguente insufficiente organizzazione tridimensionale.

In base al tessuto che si vuole riprodurre, ci sarà dunque un valore ottimale di porosità che si dovrà ottenere in fase di sintesi dello scaffold; soluzione del problema che può essere facilitata impiegando, ad esempio, nanofibre con opportuna resistenza meccanica intrinseca.

                                     

3.2. Tessuti artificiali e naturali Sintesi di tessuti tridimensionali e tecniche di fabbricazione degli scaffold

Il processo di sintesi di un tessuto in particolare quello osseo e cartilagineo può suddiviso in sei fasi:

  • inseminazione delle cellule nello scaffold polimerico in condizioni statiche su una piastra di Petri;
  • assimilazione e rimodellamento del tessuto artificiale da parte dellorganismo ospitante.
  • crescita del tessuto maturo in ambiente fisiologico con un bioreattore;
  • fabbricazione di uno scaffold bioriassorbibile;
  • crescita di un pre-tessuto in coltura dinamica con una beuta rotante spinner flask;
  • trapianto chirurgico;

Per un successo nellimpiego clinico dei tessuti sintetici tridimensionali, risulta importante che durante tutta la fase di sintesi del tessuto lo scaffold sia esposto ad una quantità sufficiente del mezzo di coltura; i bioreattori con controllo computerizzato permettono un rifornimento continuo delle sostanze nutrienti, uno scambio gassoso, leliminazione dei prodotti di scarto ed un controllo del microambiente biochimico ed idrodinamico che imita le condizioni del fluido interstiziale nel tessuto naturale.

La creazione di un letto vascolarizzato permette, quindi, la sopravvivenza, la crescita e la rigenerazione cellulare.

Esistono due strategie nella sintesi di tessuti artificiali: nella prima lo scaffold è progettato per sostenere meccanicamente le cellule e il materiale biologico fino a quando il tessuto non viene trapiantato e rimodellato dal tessuto circostante; nella seconda, invece, viene progettato in modo tale da mantenere le proprietà meccaniche fino a quando il pre-tessuto viene posto nel bioreattore, ovvero fino a quando il tessuto ingegnerizzato non abbia sufficiente integrità meccanica da autosostenersi.

Come è stato precedentemente spiegato, uno degli obiettivi della sintesi di tessuti artificiali che risulta fattore determinante per il suo successo è quello di sviluppare scaffold che imitino le proprietà chimiche, fisiche, meccaniche e strutturali del tessuto naturale che si vuole sostituire nella fattispecie dellECM; per ottenere ciò risulta fondamentale riuscire a produrre fibre sintetiche avente diametri nanometrici, con la corretta orientazione e disposizione delle fibre e dimensione dei pori.

Attualmente, nella rigenerazione di tessuti di vario tipo sia in vitro che in vivo, lutilizzo di impalcature in nanofibre nanofibrous scaffolds e nanocompositi risulta essere la tecnica maggiormente impiegata per ottenere tessuti tridimensionali sufficientemente organizzati, grazie alla loro somiglianza strutturale con lECM originaria; questa tecnica, però, spesso non permette di ottenere strutture 3D adeguatamente organizzate con dimensioni dei pori e proprietà meccaniche del tessuto finale adeguate.

Limpiego di nanofibre costituite da polimeri biocompatibili, non tossici e bioriassorbibili, permetterebbe di ottenere strutture reticolari avente unappropriata dimensione dei pori e interconnettività tra le fibre; ciò favorirebbe ladesione, la crescita, la disposizione, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare, nonché lapporto di sostanze nutritive e lo smaltimento dei prodotti metabolici.

Per aumentare determinate funzionalità dello scaffold e.g. proprietà meccaniche, adesione e crescita cellulare… sono spesso applicate delle modifiche di bulk e.g. copolimerizzazione, aggiunta di gruppi funzionali alle catene polimeriche prima della fabbricazione dello scaffold che modificano le proprietà meccaniche e di processing del polimero o superficiali adottate successivamente alla produzione dello stesso.

Inoltre possono essere utilizzati nanomateriali come additivi alla matrice polimerica, quali:

  • polimeri funzionali: polimeri elettricamente conduttivi vengono impiegati nella riparazione di tessuti neurali e nella stimolazione dei neuroni;
  • idrossiapatite: impiegata nellingegneria osseo-tissutale come nanoparticelle miscelate a polimeri sintetici o naturali e.g. collagene in quanto imita la dimensione dei cristalli minerali nelle ossa e negli altri tessuti mineralizzati;
  • nanoparticelle metalliche e nano-materiali a base di carbonio.

La produzione di scaffold in nanofibre è resa attualmente possibile da tre differenti tecniche di nanofabbricazione:

  • phase separation separazione di fase;
  • elettrospinnig.
  • self-assembly auto-assemblaggio;
                                     

3.3. Tessuti artificiali e naturali Self-assembly

La tecnica del self-assembly sfrutta lorganizzazione spontanea e autonoma dei singoli componenti in strutture ordinate e stabili senza lintervento umano grazie alla formazione di legami non-covalenti; simulando, perciò, il naturale processo di assemblaggio dellECM.

Questa tecnica, pur permettendo la produzione di nanofibre avente diametri dimensionalmente consistenti con i corrispettivi naturali, è difficilmente applicabile su scala industriale causa la complessità della procedura e la bassa produttività.

                                     

3.4. Tessuti artificiali e naturali Phase separation

La separazione di fase è un processo termodinamico dove un sistema omogeneo multi-componente genera fasi multiple per abbassare lenergia libera del sistema.

Nel caso specifico di soluzioni polimeriche si genera una fase ricca di polimero ed una ricca di solvente povera di polimero, grazie ad unattivazione termica o con laggiunta di un non-solvente; la separazione di fase porta alla formazione di un gel cui viene aggiunta acqua per estrarre la fase ricca di solvente.

In seguito il gel viene raffreddato al di sotto della temperatura di transizione vetrosa del polimero e liofilizzato sottovuoto processo di freeze-drying; questa fase permette la sublimazione dellacqua contenuta allinterno del gel formando una schiuma polimerica i cui vuoti corrispondono alla fase ricca di solvente estratta.

Questo processo produttivo permette la sintesi di un network fibroso percolativo che si traduce in membrane polimeriche porose e scaffold con strutture simili ad una spugna.

È possibile controllare la dimensione dei pori e linterconnetività delle fibre variando la concentrazione, la dimensione e la geometria degli agenti porogeni aggiunti nella soluzione polimerica durante il processo di separazione di fase.

Una limitazione a questa tecnica è dovuta al ristretto numero di polimeri processabili ed al fatto che è limitata, come il precedente processo di self-assembly, alla scala di laboratorio.

                                     

3.5. Tessuti artificiali e naturali Elettrospinning

Lelettrospinning è una tecnica molto semplice e pratica che permette di sintetizzare strutture fibrose tridimensionali complesse con un controllo sullallineamento delle fibre; tale semplicità lha resa attualmente lunica tecnica di processing di nanofibre applicabile su scala industriale nella produzione di massa.

Lo scaffold prodotto con questa tecnica presenta unarchitettura simile a quella delle proteine strutturali che costituisco lECM, con nanofibre caratterizzate da unalta area specifica e rapporto daspetto tali da aumentare larea di contatto e quindi ladesione di cellule, ligandi, fattori di crescita e altre biomolecole; inoltre è possibile regolarne la porosità, la forma le dimensioni nonché ottenere le desiderate proprietà e funzionalità modificandone la composizione.

Per i motivi sopracitati, gli scaffold in nanofibra prodotti tramite elettrospinning possiedono una potenziale applicazione in molti settori biomedici.

Uno dei limiti dellelettrospinning è la bassa velocità di infiltrazione cellulare dovuta alle piccole dimensioni dei pori dello scaffold in rapporto alle dimensioni medie delle cellule spesso comparabili, la quale provoca un ritardo nella crescita del tessuto.

Un sistema di elettrospinning è in genere costituito dai seguenti componenti principali: una sorgente di potenza ad alto voltaggio, una pompa a siringa syringe pump, una siringa, una filiera e.g. punta di pipetta, ago…, un dispositivo di raccolta con messa a terra di solito uno schermo metallico, un piatto o un mandrino rotante.

Il processo consta dei seguenti passaggi:

  • la grande velocità che raggiunge il getto permette al solvente, durante la sua propagazione, di evaporare gradualmente;
  • si carica la soluzione polimerica nella siringa che va ad alimentare la filiera di solito un ago;
  • quando il campo elettrico applicato e quindi la forza elettrostatica supera la tensione superficiale della goccia, il cono di Taylor subisce unelongazione fino ad emettere un sottile getto polimerico diretto verso il dispositivo di raccolta;
  • tramite la sorgente di potenza si genera un campo elettrico tra il dispositivo di raccolta ed il capillare caricato positivamente contenente la soluzione polimerica;
  • il getto fluido viene raccolto in forma di reticolo mesh di fibre polimeriche dal dispositivo di raccolta grazie alla differenza di potenziale tra questo e la filiera.
  • sotto lapplicazione del campo elettrico esterno si forma sulla punta dellago una goccia conica o cono di Taylor per effetto dellequilibrio tra la tensione superficiale ed il campo elettrico;

La tecnica di elettrospinning permette la produzione di fibre polimeriche continue avente diametri tra i nanometri e i micrometri dipendenti dai parametri di processing impiegati che possono essere raccolte a formare un reticolo, o scaffold, di fibre non intrecciate con orientazione random o controllata, con una grande area specifica e piccole dimensioni dei pori dellordine dei µm.

Dal momento che lo scaffold prodotto dovrà imitare lECM dello specifico tessuto naturale che si intende replicare, sia da un punto di vista strutturale che delle proprietà meccaniche, chimiche fisiche e biologiche, occorre modificare e controllare diversi parametri sia in fase progettuale scelta ottimale dei materiali che di produzione e post-produzione.

La possibilità di processare un ampio numero di polimeri con la tecnica dellelettrospinning permette di modificare le proprietà meccaniche, fisiche, biologiche e di degradazione dello scaffold scegliendo opportunamente i materiali da impiegare nella fabbricazione delle nanofibre; le proprietà finali desiderate sono ottenute tramite processi di copolimerizzazione e blending polimerico che combinano tra loro differenti omopolimeri, copolimeri o blend naturali e sintetici quali, ad esempio:

  • acido polilattico PLA;
  • polidiossanone PDO;
  • blend in PGA e PCL, PLA e PCL, PDO e PCL;
  • acido poliglicolico PGA;
  • collagene.
  • elastina;
  • blend e copolimeri in PGA e PLA;
  • policaprolattone PCL;

In fase di produzione diversi parametri di processing possono essere modificati per controllare e affinare le caratteristiche le funzionalità dello scaffold prodotto:

  • volume processato: un suo aumento comporta un aumento dello spessore dello scaffold;
  • concentrazione e viscosità della soluzione polimerica: influiscono sul diametro delle fibre e.g. allaumentare della concentrazione aumenta il diametro;
  • velocità di rotazione del dispositivo di raccolta di solito un disco o un cilindro rotante: permette di controllare lallineamento delle fibre → alte velocità di rotazione comportano un allineamento delle fibre in direzione parallela alla direzione di rotazione ma possono generare una discontinuità nelle fibre, causando, inoltre, una diminuzione del diametro; basse velocità generano, invece, una loro deposizione random sul dispositivo di raccolta.
  • geometria del dispositivo di raccolta: una sua variazione modifica la dimensione e la forma dello scaffold;

Altri parametri che controllano lo spessore delle fibre e la loro morfologia sono: elasticità, conduttività e tensione superficiale della soluzione, intensità del campo elettrico, distanza tra la filiera e il dispositivo di raccolta, temperatura e umidità.

Infine modifiche chimico-fisiche in fase di post-produzione permettono di ottenere scaffold con unanisotropia e porosità controllata e funzionalità adattate alla specifica applicazione.

Sono state sviluppate diverse tecniche di elettrospinning per poter ottenere specifiche proprietà e funzionalità delle nanofibre prodotte:

  • blowing-assisted elettrospinning;
  • multilayered elettrospinning: impiegato per produrre scaffold nella rigenerazione ossea;
  • core-shelled elettrospinning;
  • two-phase elettrospinning;
  • mixing elettrospinning: permette, come la tecnica multilayered, di fabbricare scaffold costituiti da differenti polimeri.
                                     

4. Applicazioni

Tra le varie applicazioni dellingegneria tissutale si ricordano:

  • tessuto epiteliale;
  • tessuto vescicale;
  • sostituzione e riparazione di tessuti biologici
  • tessuto cardiaco;
  • tessuto nervoso;
  • substrati per la coltura cellulare: influenzano la crescita delle cellule;
  • substrati costituiti da nanocompositi polimero – vetro bioattivo per la riparazione di difetti ossei: inducono la formazione di tessuto osseo legandosi contemporaneamente ai tessuti circostanti, permettendo il fissaggio, ad esempio, di protesi.
  • costruzione di impalcature cellulari;