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ⓘ Microscopio confocale




Microscopio confocale
                                     

ⓘ Microscopio confocale

Il microscopio confocale è un microscopio ottico, uno strumento scientifico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato.

Le basi teoriche dello strumento, in senso lato, vennero poste verso la metà degli anni cinquanta dallo scienziato attivo nel campo dellintelligenza artificiale, Marvin Lee Minsky. I primi apparati progettati, effettivamente costruiti e diffusi in campo applicativo furono microscopi con tecnologia CSLM, costruiti nel Regno unito allinizio degli anni novanta ed inizialmente commercializzati dalla ditta Bio-Rad, sulla base di ricerche e prototipazioni condotte al MRC Laboratory of Molecular Biology di Cambridge da William Bradshaw Amos negli anni ottanta.

                                     

1. Caratteristiche generali

Lo strumento opera nel campo convenzionale degli ingrandimenti della normale microscopia ottica, ed è schematicamente costituito da un normale microscopio a trasmissione a cui viene sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare limmagine di un campione illuminato con una scansione punto a punto.

Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante Nipkow disk, Programmable Array Microscopes PAM, e laser. Questultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di Confocal Laser Scanning Microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo.

La sua sorgente luminosa è costituita da uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza di eccitazione richiesta. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare con differenti colori le diverse molecole presenti nel preparato, permettendo di apprezzarne la tridimensionalità.

                                     

2. Storia

Minsky realizzò il primo microscopio confocale nel 1955, mentre lavorava, come membro della Harvard Society of Fellows, su un metodo per raccogliere immagini definite di denso tessuto neuronale.

Le tecniche tradizionali disponibili allepoca ottenevano solo un diffuso bagliore, dovuto alla luce diffratta dai piani fuori fuoco: lalta densità di cellule nervose interconnesse, marcate con fluorocromi e illuminate tutte allo stesso modo, faceva sì che lobiettivo raccogliesse troppa radiazione indesiderata, riducendo di molto il rapporto segnale-rumore.

Lidea risolutiva fu quella di illuminare selettivamente un solo punto oggetto per volta e spostare tale punto sul piano focale, scandendolo nelle due direzioni del piano oggetto per creare limmagine finale.

Il progetto originale di Minsky presentava, al posto della lente-condensatore, una lente identica allobiettivo, mentre lilluminazione, fornita da una lampada allo zirconio, era limitata da un pinhole. Limmagine ridotta di questultimo andava a fuoco sulloggetto, creando un singolo disco luminoso. Un secondo pinhole, posto fra lobiettivo e il fotomoltiplicatore di rivelazione, contribuiva ad eliminare leventuale luce diffusa dai piani non a fuoco.

Ci si trova dunque davanti ad una geometria simmetrica, semplice ed elegante.

Il sistema di scansione prevedeva il movimento del campione grazie a due aste oscillanti di metallo elastico, poste ortogonalmente e controllate da elettromagneti. La variazione di intensità luminosa, modulata dal campione e tradotta in fotocorrente, creava limmagine finale grazie ad un tubo catodico a lunga persistenza.

                                     

3. Principio di funzionamento

Il metodo di formazione dellimmagine in un microscopio confocale differisce da quello di un microscopio composto convenzionale per il fatto che, mentre nel secondo il fascio di illuminazione investe lintero campione e forma istantaneamente limmagine sul rivelatore, nel primo la luce proveniente dalla sorgente illumina loggetto un solo punto per volta ed è necessaria una scansione per formare limmagine finale. Luso di questa tecnica permette di raggiungere risoluzioni assiali molto ridotte. Infatti unimmagine così ottenuta viene comunemente chiamata" sezione ottica”, in riferimento al fatto che è possibile indagare il campione nelle tre dimensioni spaziali con un metodo non invasivo.

In microscopia confocale lo spot di luce puntiforme è prodotto da un pinhole posto davanti alla sorgente, ossia in sostituzione del diaframma di campo, che risulta così fisso è molto ridotto. La luce viene poi focalizzata dal collettore e dal condensatore o dallobiettivo, nel caso di configurazione in luce riflessa sul campione, per poi essere raccolta dallobiettivo e dalleventuale oculare e focalizzata su un secondo pinhole. In corrispondenza di questo è presente anche il rivelatore dimmagine, che produce un segnale proporzionale allintensità della luce che lo colpisce.

Il pinhole di illuminazione e quello di rivelazione appartengono a piani focali coniugati e si dicono dunque confocali, da cui il nome di questa particolare tecnica microscopica.

La quasi totalità dei sistemi confocali moderni utilizza la configurazione in luce riflessa, che, come anticipato da Minsky stesso, aumenta la simmetria e la risoluzione del sistema a spese della luminosità, che si riduce per la presenza dello specchio dicroico o del beam-splitter.



                                     

3.1. Principio di funzionamento Confocalità e Principio di Köhler

Va fatto notare che la confocalità e il principio di Köhler intervengono su aspetti differenti della struttura di un microscopio e, almeno in teoria, non sono in conflitto: il rispetto del principio di Köhler determina lesistenza di due ben distinti insiemi di piani focali coniugati e la conseguente possibilità di regolare campi e aperture in modo indipendente, grazie a diaframmi posizionati in punti dellasse ottico facilmente identificabili; la confocalità comporta invece lestremo restringimento dei campi del microscopio, ottenendo una drastica riduzione della luce diffusa dai piani fuori fuoco e il notevole incremento della risoluzione assiale, grazie alla diminuzione della profondità di campo apparente.

A livello pratico, purtroppo, il rispetto del principio di Köhler in un microscopio confocale risulta molto problematico. I pinhole costituiscono un ostacolo al passaggio della luce e la soluzione che sorge spontaneamente consisterebbe nel focalizzarla proprio nel punto in cui questi sono posizionati. Ciò però non è possibile, perché in tal modo la sorgente andrebbe a fuoco sulloggetto, il cui piano è coniugato con quello dei pinhole. Si deve allora cercare di ottenere un fascio collimato tanto stretto da attraversare i pinhole con perdite trascurabili: un problema non semplice, in particolar modo quando le dimensioni in gioco sono vicine ai limiti diffrattivi dello strumento. Fortunatamente, essendo il campo oggetto idealmente puntiforme, ossia di diametro idealmente infinitesimo, il problema delluniformità di illuminazione non è tanto grave quanto in microscopia tradizionale e, con le dovute cautele, può essere adottata lilluminazione critica.

                                     

3.2. Principio di funzionamento Risoluzione confocale laterale

Si definiscono

  • r {\displaystyle r}: coordinata radiale sul piano di formazione dellimmagine r = 0 {\displaystyle r=0} nel punto di intersezione fra il piano immagine e lasse ottico del sistema
  • I r = | A r | 2 {\displaystyle Ir=|Ar|^{2}}: intensità luminosa dellimmagine
  • d }={\frac {0.62\,\lambda }{n1-\cos {\alpha }}}\simeq {\frac {1.24\,\lambda n}{NA^{2}}}}

    NB. Lo sviluppo di Taylor di cos ⁡ α {\displaystyle \cos {\alpha }} attorno a zero è cos ⁡ α ≃ 1 − α 2 +. {\displaystyle \cos {\alpha }\simeq 1-{\frac {\alpha ^{2}}{2}}+.}

    Applicando a I c z {\displaystyle I_{c}z} il criterio di Rayleigh si ottiene invece leffettiva risoluzione assiale del sistema confocale con pinhole infinitesimo in presenza della sola diffrazione:

    d c z = 0.89 λ n 1 − cos ⁡ α ≃ 1.78 λ N A 2 {\displaystyle d_{cz}={\frac {0.89\,\lambda }{n1-\cos {\alpha }}}\simeq {\frac {1.78\,\lambda n}{NA^{2}}}}

    che risulta minore dell11% rispetto a quella del microscopio standard.

    In definitiva, con limpiego della configurazione confocale, si osserva un incremento teorico delle prestazioni, dovuto alla riduzione del contributo diffrattivo e ad un aumento del contrasto.

    Si nota che le approssimazioni effettuate sono sufficientemente accurate solo per N A < 0.5 {\displaystyle NA

  • N A {\displaystyle NA}: apertura numerica dellobiettivo
  • A r {\displaystyle Ar}: ampiezza luminosa PSF sul piano immagine