Indietro

ⓘ Tecniche di in vivo imaging




                                     

ⓘ Tecniche di in vivo imaging

Tecniche per lin vivo imaging della cellula vegetale.

Le tecniche di in vivo imaging consentono di approfondire lo studio su particolari interazioni fra proteine, sulla loro funzione e localizzazione; esse consentono anche di visualizzare i diversi compartimenti cellulari e determinarne dimensioni, forma, mobilità ed eventuali fenomeni di dinamismo e risposta ambientale.

Questo tipo di tecniche si dividono principalmente in due categorie: quelle che utilizzano proteine con fluorescenza intrinseca, come GFP e RdFP, o che sfruttano i fenomeni di bioluminescenza, come luciferina o equorina, e quelle che fanno uso di sonde fluorescenti. Per sonda fluorescente si intende un colorante fluorescente o una sonda molecolare, generalmente indicati come fluorofori, usati per evidenziare regioni specifiche o per rispondere ad un determinato stimolo.

La bioluminescenza è un fenomeno di produzione di luce operata da fotoproteine presenti in alcuni organismi. Lutilizzo di tali proteine non richiede illuminazione e lintensità luminosa emessa è generalmente bassa. Le più note proteine bioluminescenti sono la Luciferasi e lEquorina.

La Luciferasi catalizza lossidazione della Luciferina: il risultato è lemissione di luce con la formazione di oxiluciferina.

L’ Equorina, invece, è una fotoproteina composta da due unità distinte, lapoproteina, con un peso molecolare di circa 22 kDa, e il gruppo prostetico coelenterazine, una molecola appartenente alla famiglia delle luciferine. In presenza di ossigeno molecolare le due componenti interagiscono spontaneamente, formando la proteina funzionale. Solitamente lEquorina è utilizzata per lo studio del ruolo dello ione Ca2+ e per il monitoraggio spazio e tempo-specifico dei cambiamenti della sua concentrazioni che si verificano nella cellula. LEquorina può essere clonata in costrutti ricombinanti che consentono di misurare le variazioni di Ca2+ nei vari distretti cellulari. Il cambiamento conformazionale dellapoproteina indotto dallo ione Ca2+, porta alla perossidazione del coenzima, che provoca lemissione di luce blu.

La proteina GFP è usata per studi di diverso genere: essa è impiegata sia in costrutti che sfruttano la sua proprietà di autofluorescenza, sia come uno dei componenti delle sonde molecolari. Le tecniche che usano GFP consentono lanalisi dellorganizzazione intracellulare e dei fenomeni di dinamismo di organuli e proteine.

La fusione di GFP con proteine dalla funzione nota o sconosciuta hanno consentito di rilevarne la localizzazione ed eventuali spostamenti da uno compartimento verso un altro. Per effettuare questo tipo di analisi la sequenza codificante della GFP viene fusa con la sequenza 5 o 3 del gene dinteresse. Questo consente la produzione di una pianta transgenica stabile in grado di sintetizzare una proteina chimerica espressa solo in determinati distretti. La formazione di una proteina chimerica di questo tipo consente anche di determinare eventuali spostamenti in seguito a stimoli ambientali o eventi inerenti allo sviluppo. Luso della GFP e delle sue varianti con differenti proprietà spettrali sono state anche impiegate per visualizzare le strutture intracellulari e per determinarne le caratteristiche. La visualizzazione di alcune strutture, come il nucleo e la parete cellulare, può essere effettuata mediante analisi microscopica semplice della GFP. Lidentificazione di altri organelli o strutture può tuttavia richiedere unanalisi più accurata: un metodo impiegato è quello di sovrapporre limmagine ottenuta analizzando la fluorescenza di proteine specifiche di un determinato compartimento con quella derivata dalluso della GFP. Per esempio, la co-localizzazione del segnale della GFP con quello rosso dellautofluorescenza della clorofilla può consentire la visualizzazione del cloroplasto.

Esistono diverse tecniche di in vivo imaging che si avvalgono della GFP e delle sue varianti: fra queste vi sono la FRET, la FRAP e la FLIP.

Il meccanismo della FRET, o Fluorescence Resonance Energy Transfer, sfrutta la presenza di due molecole fluorescenti, dette donatore e accettore. Il donatore può essere eccitato ad una specifica lunghezza donda. Tale molecola emette energia che, a sua volta, può essere trasmessa allaccettore, in grado di emettere una fluorescenza visualizzabile dalloperatore. Tale processo avviene in modo ottimale solo se le due molecole sono a distanza ragionevolmente ristretta (