Indietro

ⓘ ELISA




ELISA
                                     

ⓘ ELISA

ELISA è un acronimo derivato dallespressione inglese enzyme-linked immunosorbent assay. Si tratta di un versatile metodo danalisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza usando uno o più anticorpi ad uno dei quali è legato un enzima: tale metodica dindagine rientra nella categoria dei test immunoenzimatici. La sostanza da rilevare può essere un antigene appartenente ad un patogeno o una molecola più piccola, chiamata aptene, come per esempio per riconoscere la presenza di steroidi. Se invece di un enzima, viene usato un radionuclide per rilevare la positività del test, si parla di RIA.

Il saggio ELISA trova anche ampio uso per accertare la presenza di anticorpi contro un determinato antigene nel plasma sanguigno del paziente per accertarsi se cè stata unesposizione ad un determinato patogeno. Questo avviene nel test per lHIV per accertarsi se il sistema immunitario del soggetto si è trovato a confrontare il virus dellAIDS.

Ci sono diverse varianti del test ELISA, che si differenziano a seconda del componente che si vuole rilevare. Nel test diretto viene determinata la presenza dellantigene, in quello indiretto, la presenza di anticorpi contro lantigene. Il saggio può essere competitivo o non competitivo. LELISA non competitivo diretto si effettua secondo diverse metodiche: semplice e sandwich ELISA.

Nel metodo semplice lantigene è assorbito sulla placca e rilevato con un anticorpo marcato da un enzima. Nel metodo a sandwich lanticorpo che è usato per catturare lantigene è assorbito sulla placca, gli anticorpi assorbiti sono in seguito esposti al fluido che potrebbe contenere lantigene ed un secondo anticorpo, marcato, viene aggiunto per rilevare che lantigene è stato catturato. In questo secondo caso, gli epitopi HP2 sullantigene dei due anticorpi devono essere completamente distinti senza alcuna sovrapposizione vedi figura.

                                     

1. Metodo indiretto variante a sandwich

Il metodo prevede la copertura del fondo del pozzetto con un anticorpo specifico per lantigene che vogliamo misurare. Si esegue un lavaggio. In seguito si introduce lantigene, che si legherà allanticorpo. Si lava ulteriormente per togliere antigeni in eccesso o non legati. Si introduce un anticorpo specifico che legherà il complesso anticorpo + antigene, formando un "terzo" strato o "sandwich", da cui prende il nome il test. Allultimo anticorpo che abbiamo aggiunto, è legato un enzima specifico, e aggiungendo il suo substrato si formerà un prodotto colorato, che evidenzierà il pozzetto nel caso in cui sia presente lantigene di interesse.

Le fasi in sintesi prevedono:

  • Aggiunta dellanticorpo secondario, che può essere rappresentato da un anticorpo anti-immunoglobuline umane, che possono essere ottenute da animali di grossa taglia inoculando in essi siero umanole cui proteine sono riconosciute come antigeni estranei dal sistema immunitario dellanimale e quindi determinano la formazione di anticorpi. Questo anticorpo viene coniugato con un enzima, tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina, e lavaggio con soluzione tampone; Lanticorpo secondario si lega selettivamente allantigene, se presente, e leccesso viene lavato via. Lassenza dellantigene specifico per lanticorpo comporta che lanticorpo secondario e il relativo enzima ad esso coniugato, con il lavaggio, venga dilavato.
  • Immissione di una soluzione dellanticorpo primario, specifico per lantigene da ricercare ed individuare nel siero o in un dato liquido biologico, nei pozzetti di una apposita piastra da saggio in polistirene. Il fondo del pozzetto viene saturato con lanticorpo che aderisce al fondo dei pozzetti e leccesso viene lavato via.
  • Se lenzima usato è la fosfatasi alcalina si aggiunge come substrato p-nitrofenilfosfato; Questa sostanza provoca una reazione con la fosfatasi alcalina coniugata allanticorpo secondario producendo p-nitrofenolo di colore giallo. Se lantigene caratteristico dellorganismo patogeno è assente nel pozzetto non vi sarà neanche lenzima coniugato allanticorpo secondario e quindi la reazione non potrà avvenire.
  • Aggiunta di idrossido di sodio per bloccare la reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato;
  • Aggiunta, in soluzioni con diverse concentrazioni non note, dei campioni dei quali bisogna saggiare la presenza, o meno, dellantigene caratteristico dellorganismo patogeno e lavaggio con soluzione tampone; lantigene, se presente, si lega specificamente con lanticorpo e leccesso viene lavato via.
  • Lettura del risultato, espressione della reazione tra enzima fosfatasi e p-nitrofenilfosfato che produce sul substrato una reazione cromogenica o fluorogenica - ovvero sviluppo di colore o luce di fluorescenza - successivamente misurabile attraverso uno spettrofotometro.

Lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dellantigene che si voleva saggiare e lintensità della colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-quantitativa secondo una scala arbitraria di intensità.

Al fine di validare il test, le operazioni sopra riportate vengono effettuate in due pozzetti distinti che differiscono per il tipo di anticorpo primario che viene introdotto inizialmente: un pozzetto viene riempito con lanticorpo specifico per lantigene che si vuole individuare, mentre laltro viene saturato con un anticorpo non specifico. Affinché il test possa ritenersi valido, in primo luogo deve risultare negativo in questultimo pozzetto e nel caso in cui il campione biologico saggiato contenga realmente lantigene dinteresse, il test deve essere positivo nellaltro pozzetto, quello saturato con lanticorpo primario specifico.

Esiste anche un altro tipo di metodo indiretto nel quale sul fondo del pozzetto sono legati antigeni ai quali un anticorpo si lega in modo specifico anticorpo primario. Questo viene quindi aggiunto al pozzetto e, dopo il lavaggio si aggiunge un altro anticorpo secondario diretto contro il frammento cristallizabile Fc, catena pesante dellanticorpo primario. I due anticorpi sono prodotti in specie diverse, il primo ad esempio può essere prodotto in topo e il secondo in altro animale come la capra. Di norma lanticorpo secondario è ingegnerizzato in modo da essere coniugato ad un marcatore tag come la fosfatasi alcalina AP o perossidasi HRP che producono da substrati specifici prodotti colorati, per cui il metodo di rilevamento risulta analogo a quanto detto sopra. Lunica differenza è che sul fondo del pozzetto non sono presenti anticorpi, ma lantigene di interesse. Questo approccio è del tutto simile a quello adottato per il rilevamento delle bande proteiche su fogli di nitrocellulosa o polivinildenfluoruro PVDF nella fase finale dello sviluppo del Western blot.

Il test ELISA NON COMPETITIVO è un test qualitativo e semi-quantitativo: non fornisce un valore effettivo ma afferma la presenza o lassenza dellanalita. Il test ELISA COMPETITIVO è invece un test quali-quantitativo: fornisce un valore specifico con una deviazione standard.

                                     

2. Metodo diretto

Nel metodo diretto innanzitutto si copre il fondo del pozzetto con lestratto proteico in cui potrebbe essere presente la proteina che vogliamo misurare antigene. Si lava via leccesso per eliminare lindesiderato. Si aggiunge lanticorpo per lantigene che probabilmente è stato adsorbito al fondo del pozzetto. Questo anticorpo è coniugato con un marcatore tag enzimatico, di norma fosfatasi alcalina AP o perossidasi HRP: Horseradish Peroxidase, perossidasi di rafano. Si lava via leccesso ancora una volta. Si effettua un lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legatisi allantigene quelli combinati resistono invece al lavaggio. Infine si aggiunge il substrato dellenzima con cui è stato marcato lanti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli antigeni nel campione, visto che lenzima usato agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la luce e risulti colorato.

Ha lo scopo di ricercare specifici antigeni in un dato liquido biologico avendo a disposizione anticorpi marcati a cui questi possano legarsi o, al contrario, per ricercare specifici anticorpi avendo a disposizione anticorpi marcati che possano legarsi al frammento cristallizabile Fc di questi ultimi.

In caso di esito positivo, per conferma si esegue il Western Blot.

                                     

3. Innovazioni

La Multiple & Portable ELISA M&P ELISA patent US 7510687 by A. Mazzeo & G. Petracca usa una conformazione innovativa della fase solida: unastina di polistirene da cui protrudono 8 o 12 ogive. Lintera astina va introdotta direttamente nel campione da saggiare e tutti i passaggi successivi lavaggi, incubazione in coniugato e incubazione in cromogeno sono eseguiti semplicemente immergendo le ogive dellastina - estratta dal campione dopo opportuna incubazione - in pozzetti di micropiastre o microstrip standard, pre-riempiti con le soluzioni e i reagenti. Gli importanti vantaggi sono:

  • la tecnologia innovativa consente la realizzazione di kit da laboratorio pronti alluso e di kit portatili per analisi in campo.
  • unogiva di ogni astina non è sensibilizzata e funge da controllo negativo, per valutare la specificità per tutti i test di ricerca di anticorpi e/o antigeni eseguiti nel campione in esame;
  • non si deve effettuare la distribuzione dei campioni, dei coniugati e del cromogeno nei pozzetti di micropiastra o in microstrip; i lavaggi sono estremamente semplificati;
  • il volume del campione analizzato può essere aumentato per aumentare la sensibilità del test in campioni clinici, alimentari latte di massa, pool di uova e ambientali acqua;
  • lastina introdotta nel campione ha le ogive sensibilizzate con reagenti differenti, in modo che in ciascun campione sia possibile la ricerca simultanea di differenti anticorpi e/o di differenti antigeni, per analisi multiple o per multi-screening;