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ⓘ Deossiribonucleasi II (sito-specifica)




Deossiribonucleasi II (sito-specifica)
                                     

ⓘ Deossiribonucleasi II (sito-specifica)

Le desossiribonucleasi II sono una classe di enzimi, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizzano il taglio endonucleolitico del DNA per dare frammenti specifici a doppia elica con fosfati terminali al 5.

Questi complessi proteici sono in grado di rompere i legami fosfodiesterici del DNA a doppio filamento. Il ruolo biologico di questi enzimi è di protezione e salvaguardia della cellula: nei procarioti questi enzimi sono essenziali per il taglio e la degradazione di filamenti estranei al genoma come ad esempio quello derivante da una infezione fagica. Gli enzimi di restrizione sono in grado di distinguere i filamenti estranei perché il DNA batterico, in corrispondenza delle sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione, viene metilato.

La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo svizzero, insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith. Nel 1978 i tre ricevettero il premio Nobel in medicina "per la scoperta degli enzimi di restrizione e la loro applicazione a problemi di genetica molecolare".

                                     

1. Classi di enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono divisi in tre categorie: le endonucleasi di tipo I,II,III.

Le endonucleasi di tipo I numero EC 3.1.21.3 e III numero EC 3.1.21.5 necessitano di ATP come coenzima per il taglio e possono anche catalizzare reazioni di modificazione del DNA quali la metilazione aggiunta di gruppi metilici a basi specifiche. Le reazioni di nucleasi e metilasi sono associate. Mentre le endonucleasi di tipo I effettuano lidrolisi del DNA in punti casuali, distanti anche più di 1000 bp dal sito di riconoscimento, quelle di tipo III riconoscono il sito bersaglio ed effettuano il taglio vicino a questultimo, circa 24-26 bp dalla sequenza consenso.

Discorso a parte va fatto per le endonucleasi di tipo II, gli enzimi di restrizione propriamente detti, quelli usati in laboratorio. Questi enzimi, infatti, non necessitano di ATP per la loro funzione ed il taglio avviene in corrispondenza di sequenze molto specifiche. Hanno inoltre attività nucleasica e metilasica non associate.

                                     

2. Sequenze riconosciute

Ciascun enzima di classe II possiede una propria sequenza bersaglio detta anche sequenza consenso, che riconosce e taglia. Questa sequenza, solitamente di 4-8 paia di basi, è detta sito di restrizione e permette di tagliare il DNA a livello di quel sito. Si tratta di siti con sequenze palindromiche: se lette secondo la stessa polarità, sono identiche nei due filamenti ad es. 5.GATC.3 è palindromica perché il suo complementare è 3.CTAG.5, che letta da 5 a 3 corrisponde a GATC. Una conseguenza di questo fatto è che lenzima di restrizione è un dimero, più precisamente un omodimero, perché deve riconoscere la stessa sequenza su entrambi i filamenti. Alcuni enzimi detti rari, hanno siti di taglio poco presenti nel genoma sono quelli con le sequenze più lunghe. Altri, come EcoRI, BamHI e HindIII, tra i più utilizzati, hanno siti di taglio ben più frequenti.

Sono possibili due tipi di taglio: il taglio sfalsato ed il taglio orizzontale.

  • Il taglio sfalsato. Un esempio può essere il taglio effettuato dallenzima di restrizione EcoRI di E. coli. La sequenza consenso di questa endonucleasi è
5.GAATTC.3 |||||| 3.CTTAAG.5 Lenzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità dette coesive o sticky ends a singolo filamento al 5: 5.G AATTC.3 | | 3.CTTAA G.5 Le estremità coesive cioè "appiccicose" che si sono create, possono appaiarsi con sequenze complementari.
  • Il taglio orizzontale. Esempio di questo tipo di taglio è lenzima SmaI
5.CCCGGG.3 |||||| 3.GGGCCC.5 Il taglio di SmaI non produce estremità coesive, ma estremità "piatte" blunt ends: 5.CCC GGG.3 ||| ||| 3.GGG CCC.5
                                     

3. Applicazioni

Gli enzimi di restrizione di classe II sono utilizzati in applicazioni di tipo biotecnologico. Ad esempio, nella tecnologia del DNA ricombinante, gli enzimi di restrizione di classe II sono impiegati per il clonaggio molecolare, che consiste nellintroduzione di un gene dinteresse in una molecola di DNA detta plasmide, in grado di replicarsi in un sistema ospite, spesso batterico, per produrre grandi quantità del gene o per permetterne lespressione.

Affinché il gene venga inserito, sia il DNA del gene che del plasmide vengono trattati con lo stesso enzima di restrizione: al termine della reazione, sia il plasmide che il gene presenteranno delle estremità terminali simili. In particolare, se lenzima utilizzato produce un taglio sfalsato, le estremità coesive prodotte tenderanno ad associarsi in presenza dellenzima DNA ligasi, che catalizza la reazione di ligazione.

Unaltra applicazione pratica consiste nellanalisi, ad esempio in medicina forense, degli RFLP Restriction fragment length poymorphism, polimorfismi di lunghezza da frammenti di restrizione. Quando un sito polimorfico, contenente una sequenza consenso per un enzima di restrizione, viene mutato, è possibile osservare in maniera differenziale lattività di taglio dellenzima stesso. Se non si visualizza nessun taglio, sarà presente una mutazione sul sito specifico dellenzima. Se, in caso contrario, il taglio avviene, il sito specifico sarà intatto e non mutato.

Gli enzimi di restrizione vengono pertanto largamente usati in ribotipia.



                                     
  • sovrapponibile a quella delle deossiribonucleasi I sito - specifiche numero EC 3.1.21.3 delle deossiribonucleasi II sito - specifiche numero EC 3.1.21.4
  • sovrapponibile a quella delle deossiribonucleasi I sito - specifiche numero EC 3.1.21.3 delle deossiribonucleasi II sito - specifiche numero EC 3.1.21.4
  • determinare un palindromo. Molte deossiribonucleasi II sito - specifiche riconoscono sequenze palindromiche specifiche e le tagliano. Ad esempio, l enzima
  • nella maturazione dell RNA degli Eucarioti. Alcuni enzimi, come le deossiribonucleasi I, tagliano il DNA in maniera relativamente aspecifica senza considerare

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