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ⓘ Northern blot




                                     

ⓘ Northern blot

Il northern blotting è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare lRNA purificato da un campione, in particolare per studiare lespressione genica.

Tecnicamente, è simile al Southern Blotting, che è la tecnica analoga per il DNA da cui il Northern blot prende il nome, con la differenza sostanziale che lRNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione; per fare in modo che la mobilità elettroforetica sia solo dipendente dalla lunghezza del frammento, lRNA deve essere preventivamente denaturato solitamente esponendolo ad alte temperature. Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere eseguita in presenza di agenti denaturanti, solitamente formaldeide e formammide. Questa tecnica è stata messa a punto nel 1977 da James Alwine e George Stark della Stanford University.

                                     

1. Fasi del protocollo

LRNA è molto suscettibile alla presenza di RNasi; queste sono proteine enzimatiche che degradano lRNA sintetizzate da vari organismi, incluso luomo; sono pertanto presenti sulla pelle umana e in soluzioni contaminate da microorganismi. È essenziale sterilizzare in autoclave a 120 °C per almeno 20 minuti tutte le soluzioni e la vetreria da utilizzare per la preparazione e lanalisi dellRNA. Gli apparati elettroforetici devono essere puliti utilizzando una soluzione di NaOH. Inoltre, è necessario utilizzare dei guanti protettivi durante tutte le fasi di manipolazione dellRNA, da cambiare frequentemente. In alcuni laboratori è diffuso luso di DEPC dietilpirocarbonato, che degrada le proteine presenti in soluzione, comprese le RNasi. Deve essere inattivato per mezzo del calore; è un agente cancerogeno ed il suo uso è limitato a soluzioni non contenenti ammine. In commercio sono disponibili inibitori delle RNasi Rnasine, da utilizzare in aggiunta ai mezzi di protezione già suggeriti.

                                     

1.1. Fasi del protocollo Denaturazione

LRNA viene riscaldato a ca. 70 °C per 3-5 minuti, poi viene raffreddato rapidamente in un bagno di ghiaccio fondente. Una piccola quantità di un agente denaturante viene aggiunta solitamente formammide per mantenere lRNA privo di strutture secondarie.

                                     

1.2. Fasi del protocollo Elettroforesi

Lelettroforesi permette di frazionare lRNA in base al peso molecolare, e quindi in base alla lunghezza. Dato che lRNA in soluzione a temperatura ambiente tende a formare strutture secondarie che ne alterano la mobilità elettroforetica, un agente denaturante ad esempio: formaldeide è aggiunto al gel. Generalmente, la corsa elettroforetica avviene su gel di agarosio, a concentrazione variabile dallo 0.6% al 2-3%, a seconda della lunghezza dellRNA da identificare. È sconsigliato luso di gel di poliacrilammide, in quanto i monomeri radicalici non polimerizzati possono causare una degradazione dellRNA. Per visualizzare lRNA durante lelettroforesi, si può utilizzare letidio bromuro, che si lega debolmente allRNA ed emette luce fluorescente quando esposto a luce ultravioletta. Su gel compaiono generalmente tre bande che corrispondono dalla più alta alla più bassa alla 28s, alla 18s e alla 5s.

                                     

1.3. Fasi del protocollo Trasferimento su membrana

LRNA può essere trasferito su una membrana di nylon utilizzando il fenomeno della capillarità. Il gel viene preparato e incubato in una soluzione salina. La membrana viene poggiata al di sopra del gel ed una pila di carta assorbente viene posta al di sopra della membrana. Il movimento dellacqua e degli ioni causa il trasferimento dellRNA dal gel alla membrana, alla quale si lega mediante legami deboli. Per stabilizzare questi legami, il complesso membrana/RNA è sottoposto a crosslinking usando raggi ultravioletti.

                                     

1.4. Fasi del protocollo Ibridizzazione

Per identificare lRNA in oggetto di studio si possono utilizzare diverse metodologie, ma la più diffusa prevede lutilizzo di una sonda di DNA, cioè una sequenza di DNA complementare allRNA da identificare da cui la definizione di ibridizzazione o ibridazione. La sonda è spesso marcata con un isotopo radioattivo ad esempio 32 P oppure con una molecola facilmente individuabile con altre tecniche, ad esempio la digossigenina.

                                     

1.5. Fasi del protocollo Visualizzazione

Questa dipende dal tipo di marcatura utilizzata durante libridazione. Nel caso di un isotopo radioattivo, è possibile rilevare la posizione dellRNA legato adesso alla sonda marcata esponendo la membrana ad una lastra fotografica.

                                     
  • grande paleontologo svizzero Louis Agassiz nel 1835 fu solo nel 1978 che Blot attribuì questi fossili a un nuovo genere di anguilliformi, Voltaconger appunto
  • Ceratoichthys pinnatiformis venne descritto per la prima volta nel 1969 da Blot sulla base di resti fossili ritrovati nella ben nota Pesciara di Bolca
  • come primers per innescare la reazione di polimerizzazione i Southern blot e l ibridazione fluorescente in situ FISH Nella terminologia comunemente
  • di piccole dimensioni. Il genere Psettopsis è stato istituito nel 1969 da Blot sulla base di resti fossili ritrovati nei ben noti giacimenti fossiliferi
  • pesce è stato riconosciuto come genere a sé stante solo nel 1974 ad opera di Blot e Voruz. Eozanclus brevirostris è considerato un membro della famiglia Zanclidae
  • singolo filamento ed ibridizzato al target DNA southern blotting o RNA northern blotting immobilizzato su una membrana o in situ. Sequenze di DNA o trascritti
  • mezzaluna con le estremità appuntite. Il genere Nursallia venne istituito da Blot nel 1987, sulla base di resti fossili ritrovati in terreni dell Eocene medio
  • trasferimento dell acido nucleico a membrane per ibridizzazioni Southern blot se viene aggiunto 0, 1 - 0, 3 di SDS nei buffer di ibridizzazione, inoltre
  • genica usate tipicamente fino a quel momento analisi single gene, come northern blotting e RT PCR in grado di quantificare in modo relativo cioè utilizzando

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