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ⓘ Citometria a flusso




                                     

ⓘ Citometria a flusso

La citometria a flusso è una tecnica di laboratorio in ambito biomedico che utilizza un fascio di luce laser per la rilevazione, il conteggio, la caratterizzazione e, utilizzando strumenti avanzati, la separazione di cellule in sospensione. La citometria a flusso si avvale dellimpiego di uno strumento, il citometro a flusso che è in grado di misurare contemporaneamente alcuni parametri morfologici derivanti dallattraversamento di singole cellule da parte di un fascio di luce laser. Lo strumento è detto a flusso perché le cellule fluiscono velocemente e singolarmente attraverso il raggio di luce che le colpisce.

La citometria a flusso è utilizzata di routine nella diagnosi di patologie del sangue, ma anche, mediante disgregazione dei tessuti, di tumori o neoplasie a carico di tessuti solidi.

                                     

1. Storia

Il primo citometro a flusso, basato sullimpedenziometria e sul principio di Coulter fu messo a punto da Wallace H. Coulter e Mack Fulwyler nel 1953. In concomitanza con la scoperta del principio di Coulter, fu pubblicato un articolo sulla rivista Science.

Il primo citofluorimetro invece fu sviluppato da Wolfgang Göhde delluniversità di Münster il 18 dicembre 1968, prodotto dalla ditta Partec e commercializzato nel 1968/1969 dalla ditta tedesca Phywe AG presso Göttingen.

In quegli anni i metodi analitici di assorbimento erano preferiti rispetto a quelli di fluorescenza. Poco dopo vennero sviluppati i citometri a flusso fra cui:

  • PAS 8000 della Partec 1973
  • Citofluorografo della Bio/Physics Systems Inc. più tardi denominata Ortho Diagnostics nel 1971.
  • ICP 22 della Partec/Phywe 1977/78
  • Ampha Z30 della Amphasys 2012 il primo citometro a flusso con microfluidica localizzata su microcircuiti
  • FACS della ditta Becton Dickinson 1974
                                     

1.1. Storia Origine del nome

In principio la definizione citometria a flusso basata sulla fluorescenza in breve citofluorimetria, veniva denominata citofotometria a impulsi dal tedesco: Impulszytophotometrie, basata sul primo strumento brevettato. Nel 1976 durante la 5^ Conferenza sulla Citologia Automatizzata della Fondazione Americana di Ingegneria, tenutasi a Pensacola Florida, otto anni dopo lintroduzione del primo citometro basato sulla fluorescenza, è stato accettato il nome di citometria a flusso, che rapidamente divenne popolare.

                                     

2. Principi analitici

Il principio fondamentale sul quale si basa la citometria a flusso è la dispersione della luce. Il citometro o citofluorimetro utilizza un flusso laminare di liquido chiamato liquido di sheath - che significa guaina, ovvero che avvolge le cellule per organizzare le cellule in un flusso ordinato, costante e continuo, in modo da poter portare ogni singola cellula chiamata anche evento nella camera di conta allinterno della quale avverrà lanalisi. Il fenomeno di ordinamento delle cellule viene chiamato focalizzazione idrodinamica.

In strumenti con più di due fasci laser per il forward e side scatter, chiamati citofluorimetri, sono presenti delle fonti luminose che emettono lunghezze donda prefissate per leccitazione di fluorocromi legati ad immunoglobuline; questi complessi vengono utilizzati per la ricerca di specifici marcatori cellulari come per esempio i cluster di differenziazione, utili per la definizione della linea cellulare di appartenenza del campione.

Le modalità con cui la luce attraversando le cellule viene distribuita sia sulla stessa linea del fascio forward scatter - dispersione frontale - FSC, sia lateralmente side scatter - dispersione laterale - SSC, forniscono informazioni rispettivamente sulle dimensioni e sulla complessità interna della cellula.



                                     

2.1. Principi analitici Citofluorimetria

Nella citofluorimetria, vengono utilizzati degli anticorpi monoclonali legati a particolari molecole, chiamate fluorocromi, ovvero molecole in grado di emettere una fluorescenza se eccitate con radiazioni luminose aventi lunghezze donda specifiche. I citofluorimetri quindi, presentano sia fonti luminose specifiche per emettere radiazioni monocromatiche che rilevatori specifici. Questa particolare analisi viene utilizzata per la ricerca di specifici marcatori cellulari come per esempio i cluster di differenziazione, utili per la definizione della linea cellulare di appartenenza del campione. Grazie alla presenza di più rilevatori sullo stesso strumento, è possibile analizzare simultaneamente più parametri nella stessa acquisizione. La citofluorimetria, oltre ad essere una tecnica di analisi qualitativa, grazie ad una relazione direttamente proporzionale fra la quantità di fluorocromo e lintensità luminosa della radiazione emessa fluorescenza, è possibile avere informazioni anche sulla quantità di siti di legame per il complesso antigene-anticorpo-marcatore presenti su ogni singola cellula analizzata.

                                     

3. Citometri a flusso

I moderni citometri a flusso sono in grado di analizzare in tempo reale cioè con una restituzione dei risultati immediata e la possibilità di modificare i parametri di analisi mentre è in corso lacquisizione molte migliaia di cellule al secondo. Un citometro a flusso è simile a un microscopio, con la differenza che, invece di produrre unimmagine della cellula, la citometria a flusso offre una quantificazione ed una immunofenotipizzazione automatizzata su larga scala di parametri ottici specifici per ogni tipo di cellula. Un citometro a flusso ha cinque componenti principali: una camera di flusso, una camera di conta, un rivelatore, un sistema di amplificazione e un computer per lanalisi dei segnali.

                                     

3.1. Citometri a flusso Camera di flusso

La camera di flusso è conformata in modo da creare una corrente liquida mediante un fluido guaina, o liquido di sheat, la quale trasporta e allinea le cellule in modo che attraversino la camera di conta formando una singola linea che verrà analizzata attraverso il fascio di luce per il rilevamento delle caratteristiche fisiche o immunofenotipiche. Il fenomeno idrodinamico che sta alla base dellallineamento delle cellule è la focalizzazione idrodinamica.

                                     

3.2. Citometri a flusso Camera di conta

La camera di conta è una parte del citofluorimetro attraverso la quale, le cellule, precedentemente allineate, incontrano i fasci luminosi che determinano la lettura degli eventi e la loro caratterizzazione. Di solito è costituita da materiale trasparente, in modo da permettere alloperatore losservazione dallesterno della camera, soprattutto per controllare la presenza di bolle daria che andrebbero ad inficiare la lettura del campione e quindi lanalisi.

                                     

3.3. Citometri a flusso Fonti luminose

Le fonti luminose in un citofluorimetro possono essere di vario genere. Esistono vari tipi di lampade che emettono radiazioni luminose più o meno monocromatiche, in base alla natura del materiale di cui è composto il catodo. Le più comunemente utilizzate sono:

  • Lampade a laser raffreddate ad aria: Argon 488 nm, Elio-Neon rosso 633 nm, Elio-Neon verde, Elio-Cadmio (
  • Lampade raffreddate ad acqua: ad Argon, Krypton, laser.